摘要：目的探讨多重实时荧光PCR检测方法对川贝母及伪品鉴别的可行性。方法通过对常见贝母属植物的ITS、psbA-trnH、rbcL和matK基因序列种间变异、遗传距离及系统发育关系分析，选择进化速率快、种间变异大、种内变异小的基因作为靶基因，设计川贝母及伪品贝母的特异性引物和Taqman探针，建立一种多重实时荧光PCR检测方法。通过特异性、灵敏度及混合样本检测与测序方法比较进行方法评估。结果贝母属ITS和psbA-trnH变异位点高于rbcL和matK，通过遗传距离分析rbcL和matK基因显著低于ITS和psbA-trnH基因，以ITS作为靶基因，建立多重实时荧光PCR检测方法特异性强，灵敏度达0.01ng，对18份样本抽查检出4份伪品贝母，检测结果与构建的NJ树聚类分析结果完全一致。结论基于ITS区域序列为靶基因建立多重实时荧光PCR检测方法能够成功鉴定川贝母及其混伪品，为川贝母真伪鉴别提供依据。

百合科（Liliaceae）中的贝母属FritillariaL.是中药贝母的主要来源，此属植物全世界约有种[1]，国产贝母属的种名达到80个，变种名称52个，变型名称6个，综合研究整理，将中药贝母划分为6个类型：浙贝母F.thunbergiiMiq.、川贝母F.cirrhosaL.、伊犁贝母F.pallidifloraSchrenk、湖北贝母F.hupehensisHsiao、平贝母F.ussuriensisMaxim和安徽贝母F.anhuiensisS.C.ChenetS.F.Yin[2]。川贝母是中药贝母中药用价值最高的类群，为川贝母F.cirrhosaD.Don、暗紫贝母F.unibracteataHsiao、甘肃贝母F.przewalskiiMaxim.、梭砂贝母F.delavayiMaxim.、太白贝母F.taipaiensisMaxim.及瓦布贝母F.wabuensisMaxim.的干燥鳞茎[3]。按药材性状不同分别习称“川贝”“青贝”和“炉贝”[4]。川贝母具有清热润肺、止咳化痰、散结、降压解痉等功效，药用价值极高[5]。随着需求量的增加，川贝母的混伪品频繁出现，其中伊犁贝母、新疆贝母、平贝母、轮叶贝母等作为川贝母的混伪品频繁出现，甚至葫芦科有毒植物土贝母Bolbostemmapaniculatum(Maxim.)Franquet的鳞茎也被发现冒充川贝母出售[6]。药材质量极不稳定，直接影响到川贝母的用药安全。因此进行川贝母药材更深入的鉴定研究对于保证川贝母药材的质量及用药安全具有重要意义。

DNA条形码（DNAbarcording）由加拿大动物学家Hebert等[7]首次提出，具有不受个体形态限制、不受个体发育阶段影响、从基因水平上客观区分物种、操作方法相对简便等特点，是目前国内外最主要的分子检测技术[8-10]。近年来，ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK、rbcL＋matK这几个候选序列或序列组合由于通用性较好，扩增成功率、有效序列获得率和物种鉴定成功率较高，是植物条形码研究中重点推荐的候选序列[11-14]。俞超等[15]、徐传林等[16]通过ITS1和ITS2DNA条形码序列来鉴别贝母属，DNA测序技术虽然是检测方法的金标准，但操作步骤复杂，仪器配套成本高，局限性大，聚合酶链式反应酶切琼脂糖凝胶电泳（PCR-RFLP）法开管操作，需要通过酶切跑琼脂糖凝胶电泳来判读结果，正品与伪品混合在一起则难以区分。本研究旨在通过对常见贝母属的ITS、psbA-trnH、rbcL和matK基因序列种间变异及系统发育关系分析，选择进化速率快、长度适中稳定、种间变异大、种内变异小的基因作为靶基因，设计川贝母及伪品贝母的特异性引物和Taqman探针，建立一种多重实时荧光PCR快速检测方法，为药用贝母的快速准确鉴定及开发利用提供科学依据。

1材料与仪器

1.1材料

对照药材（批号-）购自中国食品药品检定研究院，经笔者鉴定为川贝母F.cirrhosaL.，其余18份待检样本（编号为B1～15、C1～3）分别由山东省食品药品检验研究院及四川千方中药饮片有限公司提供，样本类型均为干燥鳞茎，室温干燥环境下保存。为了更准确地评价贝母属ITS、psbA-trnH、rbcL及matK4个基因的鉴定能力，在GenBank数据库中下载平贝母、东贝母、伊贝母（新疆贝母）、浙贝母、湖北贝母、暗紫贝母、梭砂贝母、太白贝母、川贝母、甘肃贝母、轮叶贝母、瓦布贝母、及土贝母等18种常见贝母属的4种基因的序列，其序列信息见表1。

1.2试剂与仪器

植物DNA提取试剂盒，DNA分子量MakerDL、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；引物与探针由生工生物工程（上海）有限公司负责合成；2×TaqManMasterMix为DBIBioscience品牌；DNA测序由山东省农业科学院生物技术研究中心测序中心完成；ABI荧光定量PCR仪为ABI公司产品；TakaraPCR仪为宝生物工程（大连）有限公司产品；D型高速离心机为Eppendorf公司产品；凝胶成像仪为Bio-Rad公司产品。

2方法

2.1数据分析

采用DNAstar软件包中SeqMan程序对DNA测序结果校对拼接，去除低质量峰区序列；使用MEGA7.0计算贝母属种内序列变异和种间序列变异，采用相似性搜索法（BLAST1）和最小距离法（nearestdistance）[17]考察贝母属的4个基因序列的鉴定成功率，构建neighbor-joining（NJ）进化树评估4个基因在各物种之间的亲源性。

2.2DNA提取、PCR扩增及测序

称取烘干的鳞茎样品80～mg，直接研磨成粉末。使用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。PCR扩增体系25μL体系，体系内包含：2×Taqmastermix12.5μL、DNA模板2μL、正反向引物10μmol/L各取1μL，ddH2O8.5μL。引物序列见表2。扩增程序：94℃变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s（进行40个循环）；72℃延伸10min。选择PCR扩增成功的样品，切胶纯化后测序，由山东省农科院生物技术研究中心测序中心完成。

2.3川贝母特异引物及TaqMan探针的设计及外源性内标重组质粒构建

通过对贝母属序列分析比较，选择最优DNA条形码作为靶基因，设计贝母通用引物及通用探针、川贝母特异探针及平贝母、新疆贝母、伊犁贝母、轮叶贝母等伪品贝母的特异探针（表3）。使用随机序列DNA生成工具DNAux3.0产生一段DNA序列，在NCBI中BLAST无与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上下游分别连接上贝母属的通用引物序列（上游为原序列，下游为反向互补序列），从而形成bp的阳性扩增内标DNA序列，将这段扩增内标序列委托人工基因合成，合成片段连接到PMD18-T载体上，转化感受态DH5-a，质粒提取，利用ABIXL测序仪对重组质粒进行测序验证，结果与目的片段一致。采用4种不同发光基团如FAM、JOE、ROX、CY5对各个探针的5’端进行荧光素修饰，3’端的淬灭基团用Dabcyl或BHQ1或BHQ2修饰。

2.4多重荧光PCR检测方法的建立

通过对单一荧光定量PCR反应体系中的Taq酶用量、引物浓度、探针浓度和退火温度的优化，建立川贝母、伪品贝母的单重荧光定量PCR方法。其中上下游引物以1.0、2.0、5.0、10.0μmol/L为浓度梯度，探针浓度在1.0～5.0μmol/L，以1.0μmol/L浓度梯度递增，每个浓度梯度做5个平行样品，使用ABI定量PCR仪器，PCR反应条件：95℃、2min预变性；95℃、10s，56℃、35s（收集荧光信号），40个循环。在体系中引物和探针浓度优化后将退火温度设置为56～66℃，以2℃为1个梯度，共6个退火温度进行实时荧光定量PCR扩增，同一模板做5个平行样品3次重复实验，对扩增所得数据进行分析，除了以产生Ct值最小、荧光信号强度最高、Ct值标准偏差最小综合指数最高为依据外，还要考虑既保证扩增效率的同时又要确保探针的特异性等条件，最终确立最佳的退火温度。

在单一荧光PCR建立的最优体系和确保实验特异性及稳定性的基础上，在同一反应体系中加入贝母通用引物、通用探针、川贝母特异探针、伪品贝母探针和内标质控探针，并根据阈值（即Ct值）和荧光增量，对各引物、探针浓度及循环参数进行调整优化，确定多重实时荧光PCR检测体系和方法。

2.5多重实时荧光PCR方法评估

分别从暗紫贝母、梭砂贝母、甘肃贝母、川贝母、瓦布贝母、平贝母、新疆贝母、伊犁贝母、湖北贝母、轮叶贝母、浙贝母、土贝母、麦冬、百合、薏米仁、山慈姑、人参、黄精等植物中提取基因组DNA为模板，按照上述优化的反应体系和反应条件进行荧光定量PCR，检测引物和探针的特异性。

2.6DNA灵敏度评估

将川贝母、伊贝母的基因组适当稀释，测定并记录其在nm和nm的紫外光吸光度（A）值，即A和A值，用A/A来计算DNA的纯度，当纯度在1.8～2.0说明样品DNA质量满足实验要求，将DNA定量到5～10ng/μL后5倍逐级稀释作为标准品。每个反应加量为2μL，各浓度梯度样品均设置6平行，使用优化好的多重实时荧光PCR体系及条件进行扩增，评价DNA灵敏度。

2.7混合样本检测评估

在川贝母中分别掺入1%、5%、10%、25%、50%的伊贝母，对上述样品充分混匀，提取基因组DNA，DNA质量浓度在10～50ng/μL，进行多重实时荧光PCR检测，每个样品设3个平行，每个样品重复3次，每次实验的结果一致才能确定该方法的掺假检出限，通过5次实验，分析同一个样本的方差来评价多重荧光定量PCR方法。

2.8实际样本检测

利用建立的多重实时荧光PCR检测方法对18份未知样品进行源性成分检测，与测序方法对比以验证方法的准确性、可行性。

3结果与分析

3.1贝母属中药材ITS、psbA-trnH、rbcL及matK序列遗传变异分析

18份样本ITS、psbA-trnH、rbcL及matK4个基因的PCR产物经正、反2个方向引物测序，所获得的序列与Gnebank数据库中下载的序列利用MEGA7.0软件分析。分析结果（表4）表明，ITS区序列GC平均含量约64.4%，高于其他3个基因，psbA基因GC平均含量最低31.8%，序列中含有连续polyA（T）结构这对测序结果造成一定影响，降低其成功率。psbA-trnH基因变异位点为，ITS变异位点为，rbcL和matK基因变异位点仅为32和56。理想的条形码序列种间差异明显大于种内差异。通过对贝母属各条形码候选序列的种内变异、种间变异、种间最小变异和种内最大变异分析，结果表明psbA序列种间差异最大，ITS次之，rbcL和matK最小。种内差异情况同样是psbA序列差异最大，ITS种内差异较小，rbcL和matK最小。在物种水平上通过BLAST1分析，ITS、psbA-trnH鉴定效率均为%，而rbcL和matK均不足50%。因此综合分析ITS区作为贝母属最理想的DNA条形码，基于对比NJ树（图1）聚类分析结果认为ITS在其物种鉴定及聚类分析效果上具有简单、准确、高效的特点，在大量样本的物种鉴定中，具有一定的优势。

3.2多重荧光PCR检测方法的建立

提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其纯度和浓度，测定A/A值均在1.8～2.0，质量浓度在10ng/μL以上，说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。通过对引物浓度和探针浓度优化，确定最佳引物混合物终浓度为5.0μmol/L，总反应体系为20μL，包括2×TaqManMasterMix10.0μL，引物（正向和反向，10.0μmol/L）1.0μL，探针混合物（5.0μmol/L）1.0～2.0μL，DNATemplate（1～20ng/μL）2.0μL，ddH2O6.0μL（表5）。PCR最佳反应条件：95℃、2min；95℃、10s；58℃、35s；40个循环，在此收集信号。待测样本检测结果判定：在同时进行的空白、阳性对照实验结果正常的情况下，被检测样品应有相应荧光信号检出，且相应荧光通道出现明显的扩增曲线，Ct值≤35，说明DNA提取是有效的。

3.3多重荧光PCR特异性实验

按照“2.4”项方法针对川贝母和伪品贝母的引物和特异性探针进行特异性验证，当FAM、JOE、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct值≤35说明待检样本检出川贝母源性成分（图2）；当ROX、JOE、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct值≤35说明待检样本检出伪品贝母源性成分（图3）；当只有CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct值≤35说明待检样本中不含有贝母类源性成分（图4）。通过表6可以进一步验证，川贝母和伪品贝母的引物与探针具有很好的物种特异性。

3.4多重实时荧光PCR灵敏度及扩增效率分析

对川贝母和伊犁贝母的不同质量浓度梯度扩增Ct值统计见表7，根据数据分析显示本方法的DNA灵敏度设定为0.01ng。在检出限范围内，所建立的多重实时PCR检测方法具有良好的重复性，PCR扩增效率为99.%、.77%，可见多重实时荧光PCR对扩增效率没有造成影响。

3.5混合样检测结果分析

在川贝母中分别掺入1%、5%、10%、25%、50%的伊贝母，对上述样品充分混匀，提取基因组DNA，进行多重实时荧光PCR检测，评估本研究的掺假检出限。分析结果显示，川贝母中掺入1%的伊贝母，也可以被检出。结果见表8和图5。

3.6样品检测

采用优化后的多重实时荧光PCR方法对山东省食品药品研究院及四川千方中药饮片有限公司以提供的18份贝母样品进行检测，检测结果见表9，其中有4份检测出伪品贝母的源性成分，其余14份均为川贝母，其鉴定结果与所测序列构建NJ树聚类分析结果（图1）完全一致。

4讨论

《中国药典》年版共收载贝母类药材6种，分别为土贝母、川贝母、平贝母、伊贝母、浙贝母、湖北贝母。除属于葫芦科的土贝母外其他均属于百合科。川贝母收载6种基原植物，即川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、太白贝母或瓦布贝母的干燥鳞茎。本研究通过对ITS、psbA-trnH、rbcL及matK序列遗传变异分析发现：贝母属ITS变异位点比例占46.35%，psbA-trnH基因变异位点占58.31%，rbcL基因和matK基因相对保守仅占3.0%和4.65%。ITS、psbA-trnH、rbcL及matK基因K2P遗传距离分别为0.、0.、0.、0.。可见rbcL和matK种间差异基因显著低于psbA-trnH和ITS基因。由于psbA-trnH基因GC含量低，存在polyA或PolyT结构鉴定效率明显低于ITS区域序列。

通过系统发育树对18个品种的贝母属植物ITS基因序列进行聚类分析，构建NJ系统发育树发现物种的聚类情况分析准确度高，能在一定程度上准确区分川贝母类群、浙贝母类群、北方高纬度地区贝母类群（伊犁贝母）、湖北贝母和土贝母5个中国贝母主要类群。但是对于新疆地区贝母和东北地区的平贝母无明显区分能力。原因新疆地区贝母和东北地区的平贝母的ITS、psbA-trnH、rbcL及matK基因序列差异均很小。

目前利用PCR-RFLP法鉴别川贝母方法已纳入《中国药典》年版，该方法基于DNA条形码技术专属性强，可准确有效鉴别川贝母真伪，但也存在周期长，开管操作易污染等缺点；李敏等[18]利用特异性PCR法鉴别浙贝母，应用此方法虽然不需要经过测序，直接通过特异性条带进行检测，但是该方法操作容易出现假阳性，相对误差大。目前也有SYBRGreenI法用于鉴定川贝母[19]，但该方法产生的非特异性产物较多，会导致高背景和假阳性。而本研究通过综合分析评价ITS、psbA-trnH、rbcL及matK4种基因的在贝母属植物中的鉴定能力后，选择ITS区域序列作为靶基因，设计川贝母及伪品的特异引物及特异探针，同时设计贝母的通用探针，并通过人工设计合成一段阳性扩增内标可有效排除PCR体系中存在抑制成分而造成假阴性[20]。利用多重多色实时荧光PCR技术，一管反应同时鉴别川贝母、伪品贝母以及川贝与伪品贝母的混合品，大大提高了检测效率和实用性。通过对市场上川贝母样品的抽样检测，其4份检出为伪品贝母，检测结果与所测序列构建NJ树聚类分析结果完全一致，说明此方法对于鉴别川贝母专属性强，准确率高，具有操作简单、时间短、无污染、应用广泛等优点，为川贝母真伪鉴别提供新依据。

参考文献（略）

来源：刘艳艳，张全芳，范阳阳，谭晴晴，姜欣欣，汪冰，葛付存，林永强，步迅，张永清.药用贝母属系统发育关系分析及多重实时荧光PCR检测方法的建立[J].中草药,,50(9):-.